Leiden, Franeker, Groningen en Utrecht waren in de zeventiende eeuw in het trotse bezit van een universiteit. Onder meer in Dordrecht, Middelburg, Deventer, ’s-Hertogenbosch en Breda bevonden zich illustere scholen. In Gelderland vochten vier steden om de eer van zo’n instelling: Arnhem, Harderwijk, Zutphen en Nijmegen. In Harderwijk was al in 1600 een illustere school opgericht, die in 1648 door de Staten van Gelre tot Gelderse universiteit verheven werd. Nijmegen had zich vanaf het begin tegen de keuze van Harderwijk gekeerd en in 1654 richtte de stad een eigen hogeschool op.
De opening werd op 3 mei 1655 plechtig gevierd in de Stevenskerk. De school kende toen nog maar drie hoogleraren, de predikant Guillaume Soudan, die filosofie onderwees, Christophorus Wittichius, die wijsbegeerte en theologie gaf, en de jurist Petrus de Greve, die men uit Harderwijk had weggekocht. Nadat in 1656 nog stadsdokter Emmanuel de Mandeville was benoemd voor onderwijs in de geneeskunst en Johannes Schultingius uit Duisburg kwam om geschiedenis en welsprekendheid te geven, kon de school op 3 mei 1656, precies een jaar na de opening, tot universiteit worden verheven. Die status werd overigens niet verleend door alle Staten van het gewest Gelre, maar alleen door de Staten van het Kwartier van Nijmegen. Vandaar dat de universiteit bekendstaat als ‘Kwartierlijke academie’.
In de jaren na de verheffing kwam de universiteit tot bloei. Het aantal studenten groeide gestaag tot zo’n zeventig. Wekelijks werden achttien colleges gegeven, het merendeel in de Commanderie van Sint Jan, waar zich ook de stedelijke bibliotheek bevond. Voor het onderwijs werden twee globes van de beroemde Amsterdamse uitgever Blaeu aangeschaft. Het medische praktijkonderwijs vond plaats in de vergaderkamer van het chirurgijnsgilde, boven de boog die uitkomt op het St. Stevenskerkhof.
Vanaf 1665 ging het bergafwaarts. Eerst werd de stad opgeschrikt door een nieuwe pestepidemie, die een van de professoren het leven kostte. Dat leidde tot een stagnatie in de groei. Vervolgens had Nijmegen te lijden van concurrentie: in 1670 en 1671 vertrokken twee excellente professoren naar Leiden. In 1672 zorgde een Franse invasie ervoor dat alle onderwijs stil kwam te liggen. Na het vertrek van de Fransen lukte het niet voldoende financiële middelen bijeen te krijgen om opnieuw te beginnen. In 1679 kwam een vroegtijdig einde aan de eerste Nijmeegse universiteit.